天然蛋白质作为生物大分子具有很多生理学功能，如催化、调节、转运和贮存等等，但这些蛋白质只能适应生物自身的需要，不能广泛用于产业化开发，因而需要加以改造。1983 年，Ulmer 在《Protein Engineering》中，首次提出了蛋白质工程这个名词，它是指按照人们某些特定的需要，分析蛋白质的结构与功能，进而对蛋白质进行分子设计和改造。自此以后，蛋白质的改造技术发展极为迅速，并取得了一系列重要成果。然而，这些成果多数是采用“理性设计”的方法，需要事先分析蛋白质的结构，预测和构建三维结构，然后采用定点诱变的方法，插入、删除或置换相应的密码子，或对编码蛋白质的基因进行改组，从而获得具有新功能的蛋白质。由于这类方法只适用于结构与功能之间的关系已经比较清楚的蛋白质，对于分子结构不明确的蛋白则很难改造(Chen and Arnold, 1993)。在这种情况之下，一种非理性的方法——蛋白质定向进化(directed protein evolution)应运而生。

蛋白质定向进化，又称为蛋白质的体外进化，是20 世纪新兴起的一种有效改造蛋白质的分子生物学手段，属于分子进化的一个分支。蛋白质定向进化能在实验室条件下，模拟达尔文优胜劣汰的进化过程，利用高通量筛选方法在较大的突变文库中获得目的突变体，再将这些筛选出来的突变体作为模板基因进行下一轮的进化，在短时间内创造出在自然界并不存在或需经过几百年进化才能得到的蛋白质，具有简便、快速和高效等特点。

目前，通过定向进化对蛋白质进行改造，在工业、农业和药业等领域已经有了广泛的应用。Schmidt 等(2006)用易错PCR 对酯酶进行改造，改造后的酶显示出很高的对映体选择性(E=96)及活性(2 min 底物转化达到50%)；Zhang 等(2006)对纤维素酶进行改造后，大大改善了酶的活性、稳定性和最适催化条件等；Raviprakash 等(2006)用DNA 改组方法改造登革热DNA 疫苗，使其嵌合DNA 同时具有3 种甚至全部(4 种)登革热抗原决定簇；Luginbühl 等(2006)用易错PCR 及DNA 改组方法对抗疯牛病PrP 抗体进行改造，得到了BoPrP (90-105)亲和力最强(达到1 pM)的seFv 片段。随着生物技术的不断发展，改造后的蛋白质将在各领域中发挥越来越重要的作用。1991 年，Bailey (1991)、Stephanopoulos 和Vallino(1999)分别提出了代谢工程的概念，强调了DNA 重组技术在细胞代谢网络中的重要作用：通过定向改造细胞中的酶，改善细胞的代谢途径，从而优化整个代谢网络。这一理念的提出，开辟了蛋白质定向进化在微生物代谢调控中的应用。微生物在自然界中分布广，种类多，与人类的关系密切相关。通过微生物代谢，可以降解一些有毒有害物质或合成一些重要的物质，其体内的酶能够实现生物纺织和造纸等很多重要的绿色工艺，因而如何改善微生物代谢，使其更好地为人类服务成了工业生物技术的核心。

本文介绍了蛋白质定向进化的主要关键技术，评述了其在微生物代谢调控中的应用：利用蛋白质定向进化手段对微生物细胞代谢中的关键酶、转运蛋白和调控蛋白等进行分子改造，构建具有高生产能力的工程菌，改善其代谢能力，提高代谢产物的性能，为定向进化技术在微生物代谢中的应用奠定基础。

1 蛋白质定向进化技术
从1981 年首次报道的利用寡核苷酸定点突变来研究蛋白质功能以来(Wallace et al., 1981)，蛋白质的突变技术已经发生了较大的变化，特别是随着分子生物技术的突飞猛进，已经涌现出了一系列蛋白质定向进化方法，以下列举了几种在蛋白质定向进化技术发展过程中具有较大意义且应用较为广泛的改造方法。

1.1 易错PCR 技术(error-prone PCR)
易错PCR (Gram et al., 1992)是一种在目的基因中随机引入突变，进而获得蛋白质分子随机突变体的方法。它通过改变传统PCR 的反应条件，如提高Mg²⁺浓度、改变体系中4 种dNTP 的浓度比例或使用低保真度的Taq 酶等，在扩增过程中随机引入突变而创造序列多样性文库(Ling and Robinson, 1997)。选择合适的突变频率是此方法的关键之处，频率太高会使有害突变体增多，太低又不能达到突变的果，很难获得理想的突变体。一般情况下，只经一轮PCR很难得到理想的结果，因而采用多轮易错PCR 策略，进行连续反复的随机诱变，使有益突变不断积累，最终得到所需的突变体。这种方法虽然简单快速，但是应用范围较有限，一般要求一个序列只有2~3 个碱基突变或1个氨基酸残基突变(Arnold et al., 2001)。另外，该方法只能发生点突变而不能将不同序列来源的有益突变结合到目标序列中，因此易错PCR 也被称为蛋白定向进化的“无性”进化方法。

尽管新的定向方法不断出现，但易错PCR 作为传统的进化手段，仍被广范应用。Stephens 等(2009)将易错PCR 产物克隆到大肠杆菌中构建含有960 个突变株的基因文库，并用含木聚糖的琼脂板筛选。突变后的酶具有良好的热稳定性和耐碱性，并可经DNA改组后产生适用于工业化的木聚糖酶。Liao等(2010)为提高植酸酶活性，利用易错PCR 对植酸酶突变体基因进行修饰。他们将突变后的线性基因插入到质粒载体pPIC9K，通过电击方法转到毕赤酵母GS115 中，并从5 500 个转化子中筛选出了酶活性最强的转化子PP-NPep-6A。与出发菌PP-NPm-8 相比，突变体产生的酶的比活力增强了61%，催化效率提高了84%。张赛等(2011)对黄曲毒素解毒酶基因经过两轮易错PCR，分别得到突变酶A1773、A1476 和A2863，与野生酶相比，其酶活分别提高了6.5 倍、21 倍和12.6 倍。

1.2 DNA改组技术(DNA shuffling)
继寡核苷酸定点突变和易错PCR后，Stemmer (1994)提出了另一种实现体外分子进化的方法——DNA改组。其基本原理是：先用DNaseⅠ或超声波将目的基因随机切成许多小片段；然后自发引发PCR，利用PCR将这些小片段重新组装；然后再用基因外引物扩增全长基因。DNA改组能将有益突变直接重组，从而克服了传统定点突变成功率低的缺陷，也克服了易错PCR只能发生点突变而不能进行序列小片段之间交换的缺点。DNA改组能在短时间内创造出大量的突变体，缩短了漫长的进化过程，大大提高了进化效率。

传统的DNA改组技术虽然能达到蛋白质分子改造的目的，但仍存在很多缺点，如有益突变频率低、筛选工作艰巨、进展缓慢等。Crameri等(1998)提出了DNA家族改组技术，并利用该方法对4个不同来源的具有一定同源性(58%~82%)的头孢菌素C酶基因进行了改造，结果发现经该法得到的菌株对头孢菌素C的抗性提高了270~540倍，进化速率比采用单个基因改组方法高了34~58倍。由此可见，DNA家族改组具有有益突变交换快速和积累的特性，使得突变率大大提高。

随后，DNA改组技术也不断地在改进，Kikuchi等(1999)提出了限制性内切酶代替DNaseⅠ的Family Shuffling方法。他们用限制性内切酶切割一组同源基因，避免了由DNaseⅠ随机切割DNA带来的亲代同源片段基因自身随机拼接问题，大大提高了同源基因间的同源片段重组效率。另外，他们还发现使用单链DNA为模板，可以克服双链DNA的自身退火现象，提高嵌合体的形成率，因而提出了单链模板的家族改组(Kikuchi et al., 2000)。他们以单链DNA为模板改组儿茶酚双加氧酶，嵌合基因高达14%，远远高于以双链DNA为模板的1%的嵌合基因，得到的嵌合基因编码的儿茶酚双加氧酶也远比亲本酶XylE和NahH稳定。

1.3交错延伸技术(stagger extension process, StEP)
Zhao等(1998)以枯草芽孢杆菌蛋白酶E基因为对象，首次提出了交错延伸技术重组方法。该方法将带有不同突变的同源性基因混合，进行多轮PCR扩增反应，在每一轮PCR循环中，缩短退火和延伸时间，使那些部分延伸的片段与含不同突变的模板随机杂交后继续延伸。由于模板的转换，最终形成的大多数产物序列中包含了不同亲本的序列信息。该法对最初的DNA改组进行了一定的创新，省去了DNA酶切步骤，减少了实验环节，有效缩短了实验周期并降低了操作难度。试验中，他们以筛选到的5个在65℃半衰期为野生型3~8倍的突变体为模板进行等量混合，经改组后得到了一系列在75℃下稳定的突变体，其中最稳定的突变体在65℃时半衰期为野生型的50倍。

1.4临时模板随机嵌合技术(random chimeragenesis on transient templates, RACHITT)
临时模板随机嵌合技术(Pelletier, 2001)是指在两个相同家族亲本基因之间，将一个亲本基因随机切割成DNA片段并以另一个亲本DNA为临时模板进行杂交，再经修剪、延伸、连接，形成完整的DNA新链，最后以新链替代原来的临时模板合成子链，形成高度重组的多样性文库。与DNA改组技术相比，它的优越性主要体现在不需要经过热循环、模板转换等步骤就能获得诱变基因文库，还能得到小基因(小于5 bp)重组片段。在微生物脱硫途径中，由dszC基因编码的二苯并噻吩单加氧酶(DBT-MO)是催化该途径的第一个限速酶。该基因可从红平红球菌IGTS8 (Piddington et al., 1995)和诺卡氏菌A3H1 (Coco et al., 2001)中获得，其中从A3H1中表达的DBT-MO对底物具有较高的亲和力和较广的适用范围，而从IGTS8中表达的DBT-MO对一些稀少的烷基化二苯并噻吩具有很高的比反应速率。Coco等(2001)利用RACHITT方法重组了这两个同源性基因，得到的dszC基因长1.25 kb、相似度高达89.9%。

1.5渐增切割法产生杂和酶技术(incremental trun- cation for the creation of hybrid enzymes, ITCHY)
以上几种重组技术都是建立在同源性基础之上，要求序列的同源性在70%或90%以上，而自然界中很少有序列能够满足这个要求的，应用受到了一定的限制。为突破该瓶颈，Ostermeier等(1999)建立了渐进切割产生杂合酶技术，是通过构建携带不同基因的两种重组噬菌体质粒并进行渐进切割、重组来构建杂合突变文库的技术。该技术可在没有同源性限制条件下，产生突变文库。大肠杆菌甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶(PurN)和人的甘氨酰胺核苷酸转甲酰酶(Hgart)基因同源性只有50%，Ostermeier等(1999)人分别采用ITCHY和DNA改组对上述两种酶的基因进行突变文库构建，比较两个突变文库发现ITCHY的有效融合位点更多，活性也更强。但该方法缺点是操作较为繁琐，需要制备一系列只缺失一个碱基的DNA片段，然后再将一个基因的5’与另一个基因的3’端相连产生杂合基因库。Lutz等(2001)提出了Thio-ITCHY方法：在同一载体上串联两基因，经PCR延伸、酶切、连接后即可获得突变文库，运用该方法，Lutz等(2001)人得到了PurN的N端与hGART的C端相连的杂合基因，该基因在大肠杆菌宿主中得到成功表达，除此之外还获得了多个杂合酶。

1.6不依赖于同源性的蛋白质重组技术(sequence homology-independent protein recombination, SHIPREC)
ITCHY虽能实现不依赖于同源性序列重组，但只有当融合发生在结构相似的部位时才能获得高比例的功能性杂合子，即重组发生的前提是两基因片段有足够的相似性。针对这个问题，Sieber等(2001)提出了不依赖于同源性的蛋白质重组技术。其步骤是：(1)用含有多个限制性酶切位点的人工接头将两个相关性较远或无相关性的基因相连；(2)用DNaseⅠ对连接物进行随机化片段处理；(3)琼脂凝胶电泳回收片段；(4)用连接酶进行环化处理；(5)用限制性内切酶消化环状DNA分子，得杂合基因突变库；(6)转入合适的宿主菌中表达，获得突变的蛋白质文库。他们已经利用该方法来成功生产与膜相关的人类细胞色素P450 (1A2)和可溶性细菌色素P450，这些蛋白质仅有16%的氨基酸序列相同。

2010年，Villiers等(2010)在此基础上又提出了一种近似不依赖于同源性构建基因文库的方法——易于操作的DNA重组技术(USER friendly DNA recombination, USERec)。这种方法主要有以下几个优点：(1)与ITCHY和SHIPREC相比，利用这种方法构建的基因文库多样性高，移码频率低；(2)与交错延伸PCR相比，这种方法的实验步骤大大减少。基于它的简单灵活，可以构建大量高质量的重组基因文库，这种方法可以替代基因片段重组，并很好的应用于基因文库构建中。

1.7其它方法
随着体外定向技术不断发展，构建多样性文库的方法也不断涌现，如合成改组(synthetic shuffling) (Ness et al., 2002)、突变和单方向的重新装配(mutagenic and unidirectional reassembly, MURA) (Song et al., 2002)、基于结构的重组蛋白质工程(SCOPE) (O’Maille et al., 2002)、以寡核苷酸为基础的最大随机化过程(MAX randomization) (Hughes et al., 2003)、设计寡核苷酸的组装(assembly of designed oligonucleotides, ADO) (Zha et al., 2003)等等。近几年又出现了许多有应用价值的方法，例如随机插入删除链交换突变(random insertional and deletional strand exchange mutagenesis, RAISE) (Fujii et al., 2006)、噬菌体辅助连续进化(phage-assisted continuous evolution, PACE) (Esvelt et al., 2011)等。这些新方法的出现，为蛋白质定向改造的深入研究提供了坚实的技术基础。

2蛋白质定向进化在微生物代谢调控中的应用
代谢工程(Nielsen, 2001)是一种运用重组DNA技术，定向引入遗传突变，优化代谢调控网络的重要方法，是分子生物学与生物过程系统工程的结合。由于微生物代谢的多样性，且与动植物的代谢途径相比，微生物的代谢途径相对简单，与人类日常生产生活关系密切，因此对微生物代谢调控的研究一直备受关注。

利用定向进化手段对细胞代谢中的关键酶、转运蛋白和调控蛋白等进行分子改造，构建具有高生产能力的工程菌来满足人类对生物的特定需求，在代谢工程中具有重要的意义。利用DNA重组技术修饰特定的生化反应途径或引进新的生化反应途径，对代谢途径中相应的基因或酶进行扩增、删除、转移，来解除对其它相关基因或酶的调节，可以达到改善代谢产物性能或微生物自身性能的目的。与随机诱变育种相比，这种定性构建基因改造物种的方法更具有针对性。

在传统的微生物工业化发酵生产中，提高代谢产物性能的基本思路为：从自然界中筛选微生物并通过各种诱变技术改善其代谢能力，从而达到改善代谢产物性能的目的。例如提高代谢产物的产量、降低副产物的合成以及合成新的代谢产物等等。提高代谢产物的性能一直是科学研究、工业化生产追求的目标。

2.1提高代谢产物的产量
随着全球的能源危机及环境问题的加剧，生物燃料作为一种清洁可再生能源越来越受到人们的青睐。近来，Atsumi等(2008)发现了一种产高级醇的新途径：对产甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)中的柠檬酸合成酶(CimA)进行定向进化，利用改造后的CimA可以在大肠杆菌中以葡萄糖为底物生成1-丙醇和1-丁醇。实验中，他们以pSA63为模板，利用易错PCR建立CimA突变体的质粒文库，再以这些质粒为模板，利用DNA shuffling技术进行再次突变，经两轮筛选后得到5株CimA突变体。对这5株突变体的1-丙醇和1-丁醇产量进行检测，结果显示，这两种产物的产量分别是野生型菌株的9倍和22倍。

目前，阿弗麦菌素类似物抗寄生虫药多拉克汀(CHC-B1)已成为一种商业化药物，可由链霉菌合成得到。在其合成途径中，aveC基因编码的水合酶是控制整个途径的关键酶，用于合成两种相关联的化合物CHC-B1 (环己基-B1)和CHC-B2 (环己基-B2)。为提高目的产物CHC-B1的含量，减少副产物CHC-B2的量，Stutzman-Engwall等(2005)利用DNA重组技术(DNA shuffling)对aveC基因进行改组，将改组后的aveC基因导入到阿维链霉菌中，得到了一些改良后的aveC突变体，其中最好的突变体中有10个氨基酸发生了突变，产CHC-B2和CHC-B1的比为0.07:1，比野生型菌株提高了23倍。

2.2提高酶蛋白的底物特异性
头孢菌素类化合物是一类具有β-内酰胺特征的抗生素，可由丝状菌、放线菌、革兰氏阴性细菌等多种微生物合成，目前，由链霉菌和支顶包菌合成头孢菌素的生物途径已经被广泛研究。在链霉菌生物合成途径中，底物青霉素经扩环和羟化后可得到产物去乙酰头孢素C (DAC)，其中，扩环酶(DAOCS)和羟化酶(DACS)是该途径中两个关键酶，分别由cefE基因和cefF基因编码；在A. chrysogenum中，含有直接催化青霉素N生成DAC的酶，由cefEF基因编码。为提高对底物青霉素G的特异性，Hsu等(2004)分别从S. clavuligerus (ATCC 27064)、N. lactamdurans (ATCC 27382)和S. jumonjinensis (ATCC 29864)中提取cefE基因，从S. clavuligerus中提取cefF基因，从A. chrysogenum (ATCC11550)中提取cefEF基因，将这些基因与新克隆的基因一起经PCR扩增、DNaseⅠ酶切后，得到一些大约100 bp长度的片段，再将这些片段在聚合酶作用下随机组合，最后在Tuner (DE3)中得到表达。结果显示，定向改造后的酶对底物青霉素G的Kcat/Km值相比与野生型提高了118倍。

2.3提高菌体的底物耐受性
金黄色葡萄球菌基因中有一段与砷酸盐代谢相关的序列，含有arsC、arsB和arsR三个基因，其中arsC编码砷酸盐还原酶，可将砷酸盐还原为亚砷酸盐，arsB编码泵砷膜蛋白，形成砷离子膜通道；arsR编码调节整个抗砷操纵子转录和表达的蛋白。Crameri等(1997)从大肠杆菌中提取带有这3个基因的质粒pI258，用DNaseⅠ对其进行随机切割成大小片段作为PCR模板，利用自发引发的PCR将这些片段进行重聚，得到全长基因。含有这种突变基因的大肠杆菌能在浓度为500 mmol/L的砷酸盐环境中生长，与原始菌株相比，对砷酸盐的耐受性提高了40倍。

2.4解除代谢产物抑制
在芳香族氨基酸生物合成途径中，催化赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸合成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7磷酸(DAHP)的DAHP合成酶是该途径中的限速酶，在大肠杆菌中含有分别由aroG (Phe)、aroH (Trp)、aroF (Tyr)基因编码的3种同工酶，分别受Phe、Trp和Tyr的抑制(Nimmo and Coggins, 1981a; 1981b; Hofmann et al., 1972)。为解除代谢产物对关键酶的抑制作用，提高Phe的产量，李晓萍等(2010)以野生型大肠杆菌中的aroG、aroH、aroF基因为模板，利用DNA改组方法对aroG基因进行突变，将突变后的基因连接到pET-30a载体上建立突变文库，经筛选后得到两个aroG克隆，在一定程度上有效解除了氟苯丙氨酸对关键酶的抑制作用。

3展望
随着基因工程技术的迅速发展，利用蛋白质定向进化改变代谢流，扩展或构建我们感兴趣的生物代谢途径，极大限度地改善微生物及其代谢产物的性能等，已取得显著的成果。在对胞内代谢网络的诸多特征进行精确定量分析的基础上，利用蛋白质定向进化技术，可以优化和完善代谢调控网络。微生物代谢主要由负责细胞生命活动的蛋白质和蛋白质机器、还有相应的代谢调控网络组成。但目前蛋白质定向进化技术在微生物代谢调控中的应用还仅仅局限在某些已知代谢通路中的个别蛋白质上，还未能实现对整条代谢通路甚至整个代谢网络的蛋白质定向进化研究。

基因组测序技术的出现在一定程度上扩展了蛋白质定向进化技术的应用范围。在已知基因序列的基础上，对代谢途径中的某个或某几个蛋白进行定向进化，可以降低微生物代谢工程的盲目性，但目前这种方法仅应用于个别代谢途径。如何在微生物整体代谢水平上进行蛋白质定向进化是研究的难点，也是今后蛋白质定向进化的研究方向，它不再只是蛋白质定向进化技术和代谢工程的结合，更需要基因组学、功能基因组学以及系统生物学等技术平台的支持。

作者贡献
陈丽芳和丁洁女负责文章数据的收集、整理，论文的撰写及修改；柳志强负责文章构思与设计，指导文章的起草；郑裕国为通讯作者，负责文章的审定。

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